sábado, 31 de marzo de 2012

Practica 4

SEP                                                 SNEST                                        DGEST

INSTITUTO TECNOLOGICO DE CIUDAD ALTAMIRANO


 
MATERIA: BIOTECNOLOGIA APLICADA
PRACTICA No.4
SUBCULTIVO. (SIEMBRA DE MATERIAL YA ESTABLECIDO IN - VITRO)

PROFESOR: MC. FRANCISCO JAVIER PUCHE ACOSTA
LIC EN BIOLOGIA VIII SEMESTRE
PRESENTAN:
Ma. Yesenia Balandrano Alonso (08930258)
Diana Vely García Banderas (08930286)
Anel Mojica Macedo (08930287)
Mayra Alejandra Nambo Pérez (08930349)
Berenice Rubí Pérez Sánchez (08930354)

Cd. Altamirano, Gro. México. 23  de marzo del 2012.




ÍNDICE
                                                                                                                 Pág.

I.Antecedentes………………………………………………………………………….…5
II.Definición del problema……………………………..…………………………...…..…7
III.Objetivos……………………………………………………………………………..….8
IV.Justificación………………………………………………………….………….….......9
V.Fundamento teórico……………………………………….……………..……………10
VI.Materiales y Métodos…………………………………………………………......…..15
VII.Resultados  y discusión…..………..…………………………………………..…......22
VIII.Conclusiones y Recomendaciones………..……………………………………......25
IX.Fuentes consultadas……………….……………………..…………………….......…26
X.Anexos………………………………...…………………………………………….….27


                                                                     
I.                   ANTECEDENTES
El cultivo de tejidos vegetales o cultivo in vitro de tejidos vegetales, es una técnica de reproducción en condiciones totalmente asépticas, en la que a partir de un pequeño segmento inicial de tejido es posible regenerar en poco tiempo miles o millones de plantas genéticamente iguales a la planta madre, cuando a este tejido le es aplicado un estímulo por medio de variables físicas y químicas controladas en un medio de cultivo.  A diferencia de las técnicas tradicionales de cultivo, esta poderosa herramienta permite la propagación de grandes volúmenes de plantas en menor tiempo; así como el manejo de las mismas en espacios reducidos. Por otro lado, la técnica es de gran utilidad en la obtención de plantas libres de patógenos; plantas homocigotas, en la producción de plantas en peligro de extinción, en estudios de ingeniería genética, etc. El enorme potencial que posee esta metodología ha propiciado que en los últimos 25 años se haya incrementado el número de laboratorios de cultivo de tejidos en el país para la producción comercial de plantas ornamentales y frutales al lo que ha motivado que algunos floricultores la estén utilizando como una alternativa viable en sus programas de producción (Kite, L., 1983)
La década de los 70 puede considerarse la “década prodigiosa” del cultivo in vitro en España. De esta época saldrán los líderes que serán los responsables de los grupos más consolidados del cultivo in vitro. Líderes que, de alguna forma y porque la historia así lo quiso, completan su formación en las dos escuelas del cultivo in vitro de entonces. De una parte, destaca el Dr. White en USA que, en 1934 publica el cultivo indefinido de la raíz de tomate; por otra, merece mención especial Gautheret, en Francia que, en 1939 publica por vez primera el cultivo indefinido de callos de zanahoria. Las dos “escuelas” utilizan el cultivo in vitro como herramienta de trabajo pero mientras los americanos tratan de utilizarla como una metodología para resolver problemas reales que les preocupan, la “escuela” europea trata de utilizar el cultivo in vitro como una herramienta que le permita conocer aspectos fundamentales de la histodiferenciación celular. En aquella época las diferencias eran tan notables que mientras los europeos cerraban sus tubos de cultivo con algodón y “papel de estaño” (que era como se le llamaba entonces al actual albal) los americanos lucían en sus gradillas el colorido multicolor de los famosos Kap-uts de Bellco (Antonio Ballester, 1999).
En octubre de 1994, se inició la operación de un laboratorio de cultivo de tejidos vegetales in vitro, en el Colegio Profesional de Biólogos del Estado de Veracruz A.C. con la finalidad de desarrollar técnicas para la propagación de especies vegetales de interés ecológico y económico. En enero de 1995, se iniciaron las labores de siembra de tejidos en especies ornamentales de interés económico en la región. A la par de estas actividades, se ha hecho promoción del proyecto en los medios de comunicación locales con el fin de dar a conocer al público las ventajas de utilizar la técnica mencionada para la propagación de plantas ornamentarles difíciles de obtener por los métodos tradicionales., (Davies R.D. et al, 1980).
La totipotencialidad celular fue enunciada como teoría por Gottlieb Haberlandt en 1902, quien propuso que todas las células vegetales tienen la capacidad de regenerar plantas completas. Haberlandt no llegó a demostrar su hipótesis debido a que no pudo lograr la división celular ya que los medios de cultivo que empleaba no incluían reguladores del crecimiento debido a que esos compuestos eran desconocidos en ese momento. Recién en 1934, Philip White pudo mantener, en forma ilimitada, el crecimiento de raíces en medios líquidos a partir de ápices del tallo de tomate. Al mismo tiempo se identificó el ácido indol acético (AIA), que posibilitó el mantenimiento indefinido de callos de zanahoria y tabaco in vitro. Posteriormente se descubrió el efecto de la leche de coco como estimulante de la formación de callo sobre el cultivo de embriones de Datura stramonium. En 1948 Folke Skoog y Cheng Tsui, trabajando con cultivos de callo de tabaco, demostraron la existencia de una regulación química en la parte aérea y en la raíz. Trabajos posteriores en callos de la misma especie, con el agregado de cinética, la primera citocinina descubierta, permitieron demostrar que la diferenciación de brotes, raíces o de ambos, estaba regulada por el balance de auxinas y citocininas  (Mroginski, Sansberro y  Flaschland,  2010).

II. DEFINICION DEL PROBLEMA

En esta presente practica se realizo la  siembra de  los explantes de yuca  de manera adecuada para que no se contaminen con bacterias y hongos y se puedan desarrollar las plántulas de manera libre y logre crecer para extraerlo y cultivarlo nuevamente a un medio de cultivo in vitro. Cabe mencionar que se requiere mucho cuidado al realizar la siembra de los explantes ya que si no se realiza una buena siembra el cultivo se contaminara esto debido a que es posible que el explante traiga una cepa de hongo o bacteria o que el cloro utilizado no fue muy eficiente.
III. OBJETIVOS

OBJETIVO GENERAL
v  Conocer la forma de establecer un medio de cultivo  y la forma de sembrar los explantes en el medio de cultivo.
OBJETIVOS ESPECIFICOS
v  Conocer el manejo apropiado del material vegetal en cámara de flujo Yuca: Manihot esculenta).
v  Asimilación de habilidades en la siembra.

  
IV. JUSTIFICACION

Esta práctica se realizo con la finalidad de saber cómo sembrar un explante ya que debido a esto se realizara en un medio de cultivo en el cual será sembrado un explante de yuca (Manihot esculenta)   con la finalidad de que logre crecer libre de enfermedades. La siembra se realizo en la campana laminar la cual se preparo y fue desinfectada con alcohol al 70° para estar libre de contaminantes y se desarrollen los expalntes.
  
V. FUNDAMENTO TEORICO

5.1 CULTIVO DE TEJIDOS VEGETALES
El cultivo de tejidos vegetales se define como un conjunto muy heterogéneo de técnicas que presentan en común el hecho de que un explante o sea, una parte separada del vegetal, tales como protoplastos, células, tejidos u órganos se cultiva asépticamente en un medio artificial de composición química definida y se incuba en condiciones ambientales controladas. Estas técnicas pueden ser utilizadas en vegetales como herramientas para micropropagación, propagación rápida de clones, eliminación de virus y enfermedades, producción de haploides, aislamiento y utilización de protoplastos, cultivo de embriones, producción de fitoquímicos, ingeniería genética, mutación y selección celular, producción de semillas sintéticas y estudios básicos de anatomía, desarrollo, fisiología y nutrición vegetal. (Flaschland, 2010).
El cultivo de tejidos se inicia con la disección microscópica de la planta bajo condiciones estrictamente higiénicas con el propósito de transferir un tejido que crece activamente (los tejidos meristemáticos) con seguridad y limpieza dentro de un recipiente estéril sin introducir microorganismos contaminantes. Las células y tejidos que crecerán y se desarrollarán a partir del explante original depende de los objetivos del cultivo de tejidos. En algunos casos las células conformarán una masa aparentemente desorganizada, conocida como callo, en otros estarán presentes otras estructuras reconocibles como tallos, raíces, bulbos u otros órganos. Estos tejidos cultivados in vitro se hallan dentro de un microcosmos estéril de un recipiente de vidrio o de plástico, protegidos del medio exterior no estéril. Es esencial mantener la esterilidad del medio ambiente confinado en el recipiente, debido a que cualquier microorganismo que se gane la entrada al mismo crecerá oportunísticamente a una velocidad mucho más rápida que los tejidos vegetales y eventualmente colonizarán y matarán a los tejidos. Con el propósito de sostener el vigor de los tejidos vegetales y permitir que ellos crezcan, se multipliquen y desarrollen, esto es «cultivar los tejidos», deben proveerse además ciertos requerimientos externos. Los tejidos pueden necesitar que se los apoye o sean colocados sobre o en el interior de la superficie de un gel acuoso solidificado con agar o pueden colocarse en un medio líquido. Los tejidos también necesitarán de un suministro de los elementos minerales nutritivos que son esenciales para el crecimiento vegetal, también posiblemente algunas vitaminas, azúcares como fuente de energía y una mezcla de hormonas vegetales que se conoce que controlan el crecimiento y desarrollo de estos tejidos particulares. Para el correcto crecimiento y desarrollo del tejido en cultivo en general es necesario el suministro de luz a intensidades muy bajas, mucho menores que la de la luz solar. La acumulación en las plantas de la energía de los carbohidratos provendrá de los azúcares agregados al medio de cultivo, más que de la fotosíntesis, de manera que son innecesarios altos niveles de luz. (Neumann, K.H. 1997).
5.2 BASE BIOLÓGICA
La reproducción asexual de plantas por cultivo de tejidos es posible gracias a que, en general, las células de una planta poseen la capacidad necesaria para permitir el crecimiento y el desarrollo de un nuevo individuo, sin que medie ningún tipo de fusión de células sexuales o gametos. Esta capacidad se denomina totipotencialidad celular y es característica de un grupo de células vegetales conocidas como células meristemáticas, presentes en distintos órganos de la planta. La potencialidad de una célula diferenciada (una célula de conducción, epidérmica) para generar tejidos nuevos y eventualmente un organismo completo, disminuye con el grado de diferenciación alcanzado por esa célula, pero puede revertirse parcial o completamente según las condiciones de cultivo a las que se la someta. El éxito en la propagación de una planta depende de que se logre la expresión de la potencialidad celular, es decir, de que algunas células recuperen su condición meristemática. Para ello debe inducirse primero la desdiferenciación y luego la rediferenciación celular. En condiciones naturales, un proceso de este carácter sucede durante la formación de las raíces adventicias en el enraizamiento de estacas, la formación de yemas adventicias o cuando se busca la propagación de cualquier planta. Entre los factores más importantes para lograr la respuesta morfogenética deseada se encuentra la composición del medio de cultivo. En todo intento de propagación vegetal, ya sea in vitro o in vivo, el carácter del proceso de diferenciación está regulado por el balance hormonal propio y por el estado fisiológico del órgano, tejido o célula puesta en cultivo. Sin embargo, ese balance puede ser modificado por el agregado de compuestos que imiten la acción de las hormonas vegetales. Esos compuestos, denominados reguladores del crecimiento, son los que se emplean en los medios de cultivo para conseguir la micropropagación de una planta. (Haberlandt, G. 1902).



5.3 ETAPAS DEL PROCESO
El cultivo de tejidos vegetales es el proceso que se inicia con un explante y termina con la obtención de plantas completas, lo que involucra una serie de etapas, las cuales se enumeran a continuación:
·         Elección de la planta y/o tejido donante de explantes. En esta fase se incluyen los tratamientos, preparación y selección de las plantas madre a partir de las cuales se inicia el cultivo, siendo imprescindible comprobar la identidad (especie, variedad o cultivar) y su estado de salubridad (libre de patógenos, deficiencias o estrés).
·         Establecimiento: consiste en la desinfección de los explantes (generalmente con hipoclorito de sodio) y su posterior adaptación al medio artificial de modo de inducir callo, brote, raíz o embrión somático, según se desee. Se requiere desinfectar superficialmente el material escogido para evitar que en el medio de cultivo crezcan microorganismos, principalmente bacterias y hongos, que competirán ventajosamente con el explante.
·         Multiplicación: consiste en generar una cantidad de masa vegetal suficiente para la regeneración del número de plantas necesarias.
·         Enraizamiento: es el proceso de inducción de la formación de raíces con el fin de convertir a los brotes o embriones somáticos en plántulas completas. El enraizamiento puede realizarse tanto en condiciones in vitro como ex vitro. En el primer caso se transfieren los brotes obtenidos en la etapa anterior a un medio libre de reguladores de crecimiento o que sólo contenga auxinas. Esta operación se realiza en condiciones de esterilidad (en cabina de flujo). En el segundo caso los brotes se sumergen en una solución concentrada de auxinas y se transfieren a un sustrato limpio, no necesariamente estéril, que puede ser una mezcla de turba con perlita o vermiculita. Los brotes que se utilicen en el enraizamiento ex vitro deben ser vigorosos y poseer hojas bien desarrolladas, ya que las plantas deben realizar la fotosíntesis para obtener la energía necesaria para desarrollarse y formar las raíces.
·         Rusticación: es el paso de aclimatación de las plántulas obtenidas in vitro a las condiciones del ambiente usuales fuera del tubo o frasco, es decir al suelo o algún sustrato inerte.
El enraizamiento ex vitro permite que la fase de enraizamiento y la fase de aclimatación se logren simultáneamente y que raramente se forme callo en la base de los explantes, asegurando así una conexión vascular, continua entre el vástago y la raíz. (Hicks G.S. 1980).
5.4 TIPOS DE MORFOGÉNESIS
En condiciones de cultivo in vitro, las células somáticas pueden regenerar embriones o bien, brotes, raíces y/o flores. La embriogénesis somática y la organogénesis son dos procesos morfogénicos muy frecuentes en el cultivo in vitro de especies vegetales. La embriogénesis somática es el proceso por el cual se obtiene una estructura similar a un embrión cigótico sin que medie la fertilización de las gametas, mientras que por organogénesis pueden obtenerse tallos, raíces o flores. Estos órganos se obtienen a partir de una célula o de un grupo de células a través de un complejo proceso denominado regeneración. La regeneración comprende diferentes fases que se suceden de manera similar tanto para la organogénesis como para la embriogénesis somática. Estas fases se denominan adquisición de la competencia; fase de inducción y fase de realización. En la primera fase, las células no responden al estímulo organogénico pero adquieren esa competencia durante una fase de desdiferenciación. En la segunda fase o fase de inducción, las células son receptivas al estímulo morfogénico y hay una relación directa con el tipo, concentración y combinación de reguladores del crecimiento agregados al medio de cultivo y el órgano a desarrollar. En la fase de realización, la célula sufre las sucesivas divisiones para formar el órgano determinado. A partir de la siembra in vitro de diferentes explantes relativamente grandes y en condiciones de cultivo adecuadas, puede inducirse la formación de nuevos órganos de manera directa, sin la formación de callo. Si la formación es de brotes, raíces o flores se denomina organogénesis directa. Si en cambio se induce la formación de embriones somáticos, este proceso se denominará embriogénesis directa. Si por el contrario, a partir de la siembra de un explante in vitro se observa la proliferación de células en forma desordenada y sin ninguna función predeterminada, se iniciará la producción de callos o suspensiones celulares. La diferenciación de órganos a partir de callos, denominada morfogénesis indirecta, estará condicionada a la previa formación de los meristemoides. (Banner, J. 1936).
VI.MATERIALES Y MÉTODOS

La presente práctica tuvo lugar en el Instituto Tecnológico de Cd. Altamirano, en el laboratorio de Microbiología.
Se inicio con la desinfección de la campana de flujo laminar con alcohol preparado anteriormente al 70%. Los materiales vegetales y los medios preparados se introdujeron en la cámara, las manos se desinfestaron con alcohol al 70 %, después de secarlas completamente, se inició con el trabajo dentro de la cámara, la superficie de los recipientes con medio de cultivo se limpiaron con papel higiénico impregnado con alcohol (normalmente no se utiliza algodón, puesto que se llena de polvo fácilmente). 

Previamente se preparó cloralex al 2 % en un frasco, donde posteriormente se introdujeron los explantes dentro con ayuda de las pinzas, permanecieron ahí durante 5 minutos, se agitaba periódicamente.


Se colocaron dos frascos con agua  y un frasco con alcohol del 96%, los cuales se utilizaron para el lavado. La pinza que se utilizó anteriormente para poner los explantes en el frasco del cloralex se mete en el frasco del alcohol al 96%, se flameo para eliminar algún tipo de hongo o bacteria, y se dejó enfriar en un frasco vacío, esto se llevó a cabo al término de ser utilizado un material como pinza o bisturí.

Ya transcurridos los 5 minutos, en un vaso de precipitados se vertió el cloro que contenían los explantes y se realizó el lavado con agua estéril, se mantuvieron ahí durante un minuto, transcurrido ese tiempo se vertió el agua al vaso de precipitados y se inició con el lavado de 5 minutos, se retiro el agua nuevamente, terminado esto, se retiraron los frascos que fueron utilizados para mantener limpia el área de trabajo.
Después se colocó el frasco de alcohol, el mechero y los  frascos con pinzas y bisturí, en este orden para evitar accidentes a la hora de la esterilización.
Se utilizó una caja de Petri estéril, se empezó a trabajar en una tapa de esta, obtuvimos dos explantes con ayuda de las pinzas y con el bisturí se cortaron los extremos los cuales fueron dañados por el cloro, posteriormente se diseccionaron los explantes para que cada yema o brote quedaran separados, una vez que se termino, se esterilizaron las pinzas y se colocaron en un el frasco vacío, se tomaron otras frías.

Se tomo el frasco del medio de cultivo, se quito el sello y tapa la cual se puso sobre otra tapa de un frasco para evitar contaminación, se tomo un explante con las pinzas y se coloco en el medio con cuidando que este quedara dentro del mismo y la dirección de los ápices  hacia arriba de lo contrario se obstruiría su crecimiento, este procedimiento fue el mismo para el cultivo de explantes en el medio de  14 frascos.

Una vez culminada la siembra se sellaron los frascos y colocaron en el área de crecimiento.
VII. RESULTADOS Y DISCUSION
Se cultivaron 15 explantes in vitro de Manihot esculenta, de los cuales 5 se contaminaron por hongos en la superficie inferior del explante, lo cual se puede atribuir a que el explante se encontraba contaminado por alguna cepa de hongo o que el cloro ya no era eficiente, pero este factor no perjudico los brotes foliares en el explante.



El 33 % de los explantes sembrados in vitro han sido contaminados por la presencia de un hongo.

Según Bregmann y Moon lograron un mayor número de brotes en diversas especies de Paulownia al utilizar reguladores de crecimiento, lograron incrementar el número de brotes cuando los explantes incluían parte del peciolo.
Por otra parte Kadkade y Seibert encontraron que se mejoro la eficiencia tanto para el crecimiento en callo como para la organogénesis al exponer los cultivos a la luz roja durante cinco minutos todos los días.

VIII.CONCLUSIONES Y RECOMENDACIONES

Conclusiones:
Debido a lo realizado ya antes mencionado en la presente practica se concluye que si la siembra de material in vitro se realiza de forma aséptica: esterilizando el material a utilizar, desinfectándose las manos con alcohol, los resultados son favorables, es decir el material cultivado no se infecta de hongos o bacterias; también se concluye que probablemente la planta que se utilizo (manihot esculenta) estuvo contaminada debido a que el primer día después de la siembra se presento un micelio alrededor del explante.

Recomendaciones:
-       La forma de colocar los frascos en la campana de flujo laminar debe ser frasco con alcohol- mechero - frascos con pinzas para un mejor manejo de material que se utilice.
-       Todo el material a utilizar debe esterilizarse y estar cubierto con papel o aluminio para evitar que este se contamine.
-       Se recomienda que solo se encuentren dos personas: uno para que se encargue de sembrar el material in vitro y el otro para que lo apoye pasándole el material esto para evitar que se infecten los medios de cultivo.

IX.FUENTES CONSULTADAS
Luis Mroginski, Pedro Sansberro y Eduardo Flaschland. 2010. Establecimiento de cultivos de tejidos vegetales. En: Biotecnología y Mejoramiento Vegetal II, Argenbio, INTA. pags.: 70-84.

Kite, L. (1983), Plant from Test Tubes: an Introductions to Micropropagation. Timber Press Oregon U.S.A.

Davies R.D. et al, (1980). Proceeding of the Fourth John Innes Symposium the Plant Genoma and Second.

X. ANEXOS
v  Se adquirió un anaquel de cinco laminas para adecuar el área de incubación cerca de la campana de flujo laminar y a un lado de la ventana para recibir la poca luz sola que entra.


v  Debido a que la luz solar no es la suficiente para todos los niveles del anaquel se requiere hacer la compra de una lámpara para que todos los explantes reciban la misma intensidad de luz.










jueves, 8 de marzo de 2012

practica 3 preparacion de medios de cultivo de tejidos vegetales


SEP                           SNEST                           DGEST

INSTITUTO TECNOLOGICO DE CIUDAD ALTAMIRANO
MATERIA: BIOTECNOLOGIA APLICADA
PRACTICA No.3
PREPARACIÓN DE MEDIOS PARA EL CULTIVO DE TEJIDOS VEGETALES
PROFESOR: MC. FRANCISCO JAVIER PUCHE ACOSTA

LIC EN BIOLOGIA           VIII SEMESTRE
PRESENTAN:
Ma. Yesenia Balandrano Alonso (08930258)
Diana Vely García Banderas (08930286)
ANEL MOJICA MACEDO (08930287)
Mayra Alejandra Nambo Pérez (08930349)
Berenice Rubí Pérez Sánchez (08930354)

Cd. Altamirano, Gro. México. 27 de Febrero del 2012.

PREPARACIÓN DE MEDIOS PARA EL CULTIVO DE TEJIDOS VEGETALES
RESUMEN

La presente práctica se realizo en el laboratorio de microbiología del Instituto Tecnológico de Cd. Altamirano Gro.Cuyo objetivo fue conocer la forma de preparación del medio de Murasshine y Skoog para el cultivo de tejidos vegetales. Para lo cual se utilizó balanza, vasos de precipitados, agitador magnético, y magneto, potenciómetros, frascos limpios para almacenar soluciones, sales y reactivos para preparar las soluciones concentradas y el medio MS, phytagel, hidróxido de sodio y Ácido Clorhídrico para ajustar el pH. En un vaso de precipitados con 100 ml de agua se le agrego 3.5 ml de cada solución posteriormente se agregó 10.5 g de sacarosa para ser aforado a 350 ml en una probeta, posteriormente se vacío a un vaso de precipitados y se ajusto el pH a 5.72 agregando Ácido Clorhídrico, una vez ajustado se agregó 1.05 g de phytagel y se dejo ebullir  en el agitador magnético, por ultimo se dejo enfriar el medio de cultivo y se vacío a los frascos, los cuales fueron guardados en el refrigerador.



Palabras clave: Medio de Murasshine y Skoog, phytagel, Ácido Clorhídrico.

PREPARATIONOFMEDIAFORPLANTTISSUE CULTURE
Abstract
Thispracticewas performed in themicrobiologylaboratoryInstituto Tecnológico de Cd. Altamirano Gro.Aims to better understandhowMurasshinepreparingand Skoogmediumforplant tissue culture.Whichwas usedforbalance, beakers, magnetic stirrer, and Magneto, potentiometers, clean jarsto storesolutions, salts and reagents to preparestock solutions andMS medium,Phytagel, sodium hydroxide andhydrochloric acidfor pH adjustment. Inabeaker with100mlof water wasadded3.5 mlof each solutionthenwas added10.5 gof sucrose tobegraduatedto 350 mlin a test tube, subsequentlyvacuumtoa beakerandthe pHwas adjustedto 5.72addinghydrochloric acid,once adjusted1.05 gwas addedand allowedPhytagelboilon the magnetic stirrer, finally allowed to coolthe culture mediumandvacuumflasks,which werestoredin refrigerator.




Keywords: Middle of Murasshine and Skoog, Phytagel, Hydrochloric Acid.

ÍNDICE
Pág.
  
Antecedentes………………………………………………………………………….…5
Definición del problema…………………………………………………………...….…6
Objetivos…………………………………………………………………………………..7
Justificación…………………………………………………………….……………...…8
Fundamento teórico………………………………………….……………..……………9
Materiales y Métodos……………………………………………………………......….13
Resultados…………………………………………………………………………….....20
Conclusiones y Recomendaciones…………………………………………………..21
Fuentes consultadas…………………………………………..…………………….…22
Anexos…………………………………...………………………………………………23


I.             ANTECEDENTES
El cultivo de tejido vegetal fue desarrollado a partir de la investigación de botánicos y fisiólogos vegetales desde 1950. Actualmente se ha convertido en una herramienta internacional importante en la selección, cruzamiento, control de enfermedades y producción en masa de cultivos de cosecha e involucra diferentes plantas en agricultura, horticultura, forestales y frutales.

La ciencia del cultivo de tejidos vegetales debe su origen a la investigación sobre hormonas que controlan el crecimiento y desarrollo vegetal. Este conocimiento se combinó con las técnicas básicas de microbiología por las cuales los microorganismos se hacen crecer en medios estériles para la producción de microorganismos e identificación. Desde estas dos fuentes provino la tecnología por la cual las plantas u órganos de plantas se pueden multiplicar en gran número, o su crecimiento individual controlado, haciendo crecer pequeños trozos de tejido vegetal sobre una receta precisa de nutrientes en un recipiente estéril.

El cultivo de tejidos ha sido considerado durante mucho tiempo como una mezcla de ciencia y arte. Fue considerada inicialmente como una técnica particularmente difícil de aprender. Sin embargo, estas dificultades de los comienzos están hoy en día prácticamente superadas gracias a factores como la disponibilidad de antibióticos, los medios de composición definida, las instalaciones asépticas (salas de cultivo limpias, cabinas de flujo laminar, incubadoras estériles), dispositivos de cultivo (botellas con tapones filtrantes, placas de Petri ventiladas).
Los avances técnicos y la aparición de un buen número de compañías comerciales de suministro de medios, sueros, equipo y líneas celulares han hecho del cultivo celular una tecnología con buena reproducibilidad (Reina, 2003).

El cultivo de tejidos, como técnica, consiste esencialmente en aislar una porción de la planta (explante) y proporcionarle artificialmente las condiciones físicas y

químicas apropiadas para que las células expresen su potencial intrínseco o inducido. Es necesario además adoptar procedimientos de asepsia para mantener los cultivos libres de contaminación microbiana (Roca &Mroginski).


II.           DEFINICIÓN DEL PROBLEMA

En esta presente práctica se busca preparar medios para tejidos vegetales, debido a que es necesario aprovechar lo que la materia y el laboratorio nos permite a través de experimentos para desarrollar nuestras inquietudes. Cabe mencionar  que se requiere conocer exactamente la cantidad de cada uno de los compuestos que hay en el medio, es por ello que se debe conocer paso por paso la preparación del medio.  



III.         OBJETIVOS

3.1 Objetivo general
Ø  Conocer la forma de preparación de los medios de Murasshine y Skoog y B5 (o de Gamborg) para el cultivo de tejidos vegetales

3.2 Objetivos específicos
Ø  Comprender la función de cada uno de los componentes de un medio de cultivo
Ø  Comprender  la importancia que tiene la preparación de los medios para tejidos vegetales.




IV.        JUSTIFICACIÓN
Esta práctica se realizo con la finalidad de conocer los componentes de los medios de cultivo así mismo como la cantidad que se requiere de cada uno de las sustancias utilizadas en la preparación de estos. Los medios de cultivo se pueden preparar en el laboratorio a partir de cada uno de sus constituyentes básicos, o por simple rehidratación de productos asequibles comercialmente (medios de cultivo deshidratados). Generalmente se prefiere el uso de los medios de cultivo deshidratados porque, además de simplificar el trabajo, con ellos se tiene mayor probabilidad de obtener resultados reproducibles.


V.          FUNDAMENTO TEORICO
5.1 MEDIOS DE CULTIVO
Los medios de cultivo son una mezcla de nutrientes que, en concentraciones adecuadas y en condiciones físicas óptimas, permiten el crecimiento de los microorganismos,  estos medios son esenciales en el laboratorio por lo que un control en su fabricación, preparación, conservación y uso, asegurar la exactitud, confiabilidad y reproducibilidad de los resultados obtenidos. En los laboratorios se utilizan diferentes tipos de medios de cultivo que pueden ser preparados en forma líquida o en forma sólida. Usualmente para preparar un medio sólido, se parte de un medio líquido al que se le añade un agente solidificante como el agar, la gelatina o la sílicagel. Una vez que ha sido preparado, un medio de cultivo puede ser inoculado (es decir, se le añaden organismos) y a continuación incubado en condiciones que favorezcan el crecimiento. El crecimiento de los microorganismos es el cultivo. Un cultivo axénico o puro contiene un único tipo de microorganismos. Los medios de cultivo deben contener los nutrientes y factores de crecimiento necesarios y deben estar exentos de cualquier microorganismo contaminante. Los medios de cultivo contienen como mínimo: carbono, nitrógeno, azufre, fósforo y sales inorgánicas. En muchos casos serán necesarias ciertas vitaminas y otras sustancias inductoras del crecimiento. También se añaden colorantes que actúan como indicadores.El agar es el principal agente solidificante utilizado en medios. Sedisuelve completamente a 100°C y se solidifica al enfriarse a 40°C. (Clavell, 1992).

5.2 CLASIFICACION DE MEDIOS DE CULTIVO

De acuerdo a su consistencia, los medios de cultivo pueden clasificarse en:

Líquidos: Se utilizan para el crecimiento de cultivos puros en lote. Se denominan caldos de cultivo y no tienen agar en su formulación.


Semisólidos: Contienen 0.5% de agar en su formulación.
Sólidos: Contienen de 1.5 a 2% de agar en su formulación.
De acuerdo a su composición, los medios de cultivo pueden clasificarse en:

Definidos: es aquél medio de cultivo del cual se conoce su composición exacta. Son muy utilizados en estudios fisiológicos. Los medios mínimos son medios definidos que únicamente le proporcionan al microorganismo los nutrientes necesarios para crecer, pero no para desarrollarse óptimamente.

Complejos: es aquél del cual no se conoce la composición exacta del medio. Amenudo, los medios complejos emplean sangre, leche, extracto de levaduras,extracto de carne u otras sustancias muy nutritivas pero de las cuales se desconoce la composición química exacta. Estos medios son muy utilizados para cultivar bacterias desconocidas o bacterias de requerimientos nutricionales muy complejos.

Los medios de cultivo se pueden clasificar de acuerdo a la naturaleza de sus constituyentes en:

Medios naturales o complejos: constituidos por sustancias complejas de origen animal o vegetal, las que son usualmente complementadas por la adición de minerales y otras sustancias. en ellos no se conocen todos los componentes, ni las cantidades exactas presentes de cada uno de ellos.

Medios definidos o sintéticos: son los medios que tienen una composición química definida cualitativamente y cuantitativamente. Generalmente se usan en trabajos de investigación.

De acuerdo al uso del medio de cultivo, éstos se clasifican en:


Medios de enriquecimiento: son medios líquidos que favorecen el crecimiento de un tipo de microorganismo en particular. Permiten aumentar el número de microorganismos de ese tipo. Usualmente contienen una o más sustancias inhibidoras del crecimiento de los microorganismos con excepción de los que se quieren cultivar.

Medios selectivos: son parecidos a los de enriquecimiento, se diferencian por ser medios sólidos y están diseñados para el aislamiento de microorganismos específicos.

Medios diferenciales: son medios que contienen indicadores de productos derivados de la actividad microbiana de los microorganismos. no contienen ningún tipo de sustancia con actividad antimicrobiana, permiten revelar características fisiológicas de los microorganismos.

Los medios de cultivo se pueden preparar en el laboratorio a partir de cada uno de sus constituyentes básicos, o por simple rehidratación de productos asequibles comercialmente (medios de cultivo deshidratados), generalmente se prefiere el uso de los medios de cultivo deshidratados porque, además de simplificar el trabajo, con ellos se tiene mayor probabilidad de obtener resultados reproducibles.(Gutiérrez, 2001).

5.3 ASPECTOS  PARA  PREPARAR DE MEDIOS DE CULTIVO

prepararlos sólo a partir de productos que provengan de fabricantes o proveedores que suministren productos de calidad.

utilizar agua destilada o desmineralizada con una calidad microbiológica y fisicoquímica adecuada.


utilizar materiales de vidrio bien lavados y enjuagados con agua destilada o desmineralizada.

controlar el tiempo y la temperatura recomendada durante su esterilización. Nunca se deben exceder las condiciones señaladas por el fabricante.(Gutiérrez, 2001)

5.4 ALMACENAMIENTO DE LOS MEDIOS DE CULTIVO

Los medios de cultivo deshidratados se deben almacenar en envases sellados bajo las condiciones que señale el fabricante, generalmente se almacenan en un lugar fresco (entre 15 y 25°), con poca humedad y protegidos de la luz solar directa. Nunca se deben almacenar cerca de autoclaves, hornos, ni otra fuente de calor o vapor.
Una vez que el medio de cultivo ha sido preparado y esterilizado se debe almacenar entre 2 y 8º C, amenos que el medio requiera alguna condición diferente. Se deben mantener en recipientes bien cerradospara evitar su deshidratación. Cuando se usa tapón de algodón se debe colocar por encima una envolturade papel (Craft). (Dugas, 1999).

I.             MATERIALES Y METODOS
La practica tuvo lugar en el laboratorio de Microbiología perteneciente al Instituto Tecnológico de Cd.  Altamirano. Para la preparación de 350 mL de medio M.S partiendo de soluciones concentradas de sales y orgánicos a 100 x,  añadiendo 30 g / L de sacarosa y 3 g / L de phytagel, se llevo acabo la siguiente metodología.
Primeramente se realizó un flujo para saber la cantidad  exacta que se agregarían de cada una de las soluciones stock y los componentes como sacarosa y phytagel.
PREPARACIÓN DE UN MEDIO DE CULTIVO M.S
FLUJO
L
350 ML
SOLUCIÓN DE NITRATOS
10 mL
3.5 mL
SOLUCIÓN DE SULFATOS
10 mL
3.5 mL
SOLUCIÓN DE QUELATOS
10 mL
3.5 mL
SOLUCIÓN DE Po Bo Mo
10 mL
3.5 mL
SOLUCIÓN DE HALOGENOS
10 mL
3.5 mL
SOLUCIÓN DE ORGÁNICOS
10 mL
3.5 mL
SACAROSA
30 g
10.5 g
PHYTAGEL
3.0 g
1.05 g

Posteriormente se colocaron las seis soluciones stock sobre la mesa del centro del laboratorio, al lado derecho de cada botella que contenía la solución, se encontraba una pipeta correspondiente a cada una de ellas.


En un vaso de precipitados de 500 mL o un litro, se colocó 100 mL de agua (bonafont), después con la pipeta correspondiente se agregó 3.5 mL de cada una de las seis soluciones stock ( Solución de Nitratos, Solución de Sulfatos, Solución de Quelatos, Solución de Po Bo Mo, Solución de Halógenos y Solución de Orgánicos).
Posteriormente se adicionó la sacarosa, de la cual se pesaron previamente 10.5 g en la balanza analítica, con una pipeta se removió hasta que esta se disolviera perfectamente. Después en una probeta de 500 mL se aforó a 350 mL, se realizó un lavado del vaso de precipitados para evitar que quedaran residuos de los componentes del medio.
Una vez aforada la solución se vertió nuevamente en el vaso de precipitados para medir el pH el cual debía de estar en un rango de 5.7 a 6.0, empleando el potenciómetro. En caso de que obtuviéramos un pH bajo, se le agregaría NaOH hidróxido sódico de lo contrario si el pH sobrepasara 6.0 se agregaría HCL ácido clorhídrico 0.1 N.
Posteriormente se le agregó un magneto al medio y se procedió a calentar en una parrilla calefactora con agitación magnética, a una temperatura de 50 a 70 ºC, se midió la temperatura con un termómetro y una vez alcanzada se agregó 1.05 g de phytagel, esto se hizo poco a poco para evitar que se formaran grumos.
Ya que se implemento el phytagel se incremento la intensidad de calor hasta que hirviera. Después en frascos de cultivo se vertió el medio M.S, con mucho cuidado ya que estaba caliente, tomando la medida de un frasco llenado con agua, al termino de llenado de estos se taparon, sellaron cinta plástica y se mantuvieron en refrigeración.

I.             RESULTADOS
Para preparar 350 ml de medio MS partiendo de soluciones stock de sales y orgánicos a 100X, se añadieron 30 g/l de sacarosa y 3 g/l de phytagel.
Cálculos necesarios:
Para las soluciones

Se midió el pH el cual se encontraba muy acido y se ajusto con la ayuda del acido clorhídrico hasta 5.72.

De los 350 ml del medio Murasshine y Skoog se obtuvieron 15 frascos de 23 ml para el cultivo de tejidos vegetales, los cuales fueron puestos bajo refrigeración.
I.             CONCLUSIONES Y RECOMENDACIONES
Conclusión:

De acuerdo con lo realizado en la presente práctica se concluye que es de gran importancia  preparar adecuadamente los medios de cultivo, añadir la cantidad de solución exacta y disolverla correctamente para obtener los resultados esperados; además de que observamos que la solución stock es mas acida

Recomendaciones:

De acuerdo a esta práctica se recomienda que potenciómetro este calibrado ya que se pierde tiempo en tratar de calibrarlo, que para la posterior practica se le apliquen reguladores de crecimiento al medio de cultivo  ya que en esta práctica no se agregaron.
II.           FUENTES  CONSULTADAS

v  Clavell, L.; Pedrique de Aulacio, M. 1992. Microbiología. Manual de Métodos Generales (2da edición). Facultad de Farmacia. Universidad Central de Venezuela
v  Sofía Gutiérrez de Gamboa, Octubre 2001. http://www.ucv.ve/fileadmin/user_upload/facultad_farmacia/catedraMicro/10_Preparaci%C3%B3n_de_medios_de_cultivo.pdf

v  Dugas Beverly Tratado de Enfermería Práctica Nueva Editorial Interamericana México, 1999. http://es.scribd.com/doc/14173118/4-Esterilizacion-y-Preparacion-de-Medios-de-Cultivo

v  Biotecnología Vegetal  (cultivo de tejidos, manual )Gonzalez, Cruz, Camarillo, Silos. 2000. SEP. 133p.
v  La Ingeniería Genética y sus Aplicaciones. Pellon. Acribia. 1986. Mexico. 237 p.
v  Introduction to Biotechnology and Genetic Engineering. Nair. Infinity Science Press. India. 2008. 791 p.
v  http://exa.unne.edu.ar/biologia/fisiologia.vegetal/CultivoTejidos.pdf

III.         ANEXOS

Es necesario que el laboratorio cuente con medidores de pH  debido a que con los que cuenta el laboratorio no se encuentra en buenas condiciones y no están calibrados correctamente.