SEP
SNEST
DGEST
INSTITUTO
TECNOLOGICO DE CIUDAD ALTAMIRANO
MATERIA: BIOTECNOLOGIA
APLICADA
PRACTICA No.3
PREPARACIÓN DE MEDIOS PARA EL CULTIVO DE TEJIDOS
VEGETALES
PROFESOR: MC. FRANCISCO
JAVIER PUCHE ACOSTA
LIC EN BIOLOGIA VIII SEMESTRE
PRESENTAN:
Ma.
Yesenia Balandrano Alonso (08930258)
Diana
Vely García Banderas (08930286)
ANEL
MOJICA MACEDO (08930287)
Mayra
Alejandra Nambo Pérez (08930349)
Berenice
Rubí Pérez Sánchez (08930354)
Cd. Altamirano, Gro.
México. 27 de Febrero del 2012.
PREPARACIÓN
DE MEDIOS PARA EL CULTIVO DE TEJIDOS VEGETALES
RESUMEN
La presente práctica se realizo en el laboratorio de
microbiología del Instituto Tecnológico de Cd. Altamirano Gro.Cuyo objetivo fue
conocer la forma de preparación del medio de Murasshine y Skoog para el cultivo
de tejidos vegetales. Para lo cual se utilizó balanza, vasos de precipitados,
agitador magnético, y magneto, potenciómetros, frascos limpios para almacenar
soluciones, sales y reactivos para
preparar las soluciones concentradas y el medio MS, phytagel, hidróxido de
sodio y Ácido Clorhídrico para ajustar el pH. En un vaso de precipitados con
100 ml de agua se le agrego 3.5 ml de cada solución posteriormente se agregó
10.5 g de sacarosa para ser aforado a 350 ml en una probeta, posteriormente se
vacío a un vaso de precipitados y se ajusto el pH a 5.72 agregando Ácido
Clorhídrico, una vez ajustado se agregó 1.05 g de phytagel y se dejo
ebullir en el agitador magnético, por
ultimo se dejo enfriar el medio de cultivo y se vacío a los frascos, los cuales
fueron guardados en el refrigerador.
Palabras
clave: Medio de Murasshine y Skoog, phytagel, Ácido Clorhídrico.
PREPARATIONOFMEDIAFORPLANTTISSUE
CULTURE
Abstract
Thispracticewas performed in themicrobiologylaboratoryInstituto Tecnológico de Cd. Altamirano Gro.Aims to better understandhowMurasshinepreparingand
Skoogmediumforplant tissue culture.Whichwas usedforbalance, beakers, magnetic stirrer, and Magneto, potentiometers, clean jarsto
storesolutions, salts and reagents to preparestock
solutions andMS medium,Phytagel, sodium hydroxide andhydrochloric
acidfor pH adjustment. Inabeaker with100mlof water
wasadded3.5 mlof each solutionthenwas added10.5 gof sucrose tobegraduatedto 350
mlin a test tube, subsequentlyvacuumtoa beakerandthe
pHwas adjustedto 5.72addinghydrochloric acid,once adjusted1.05 gwas addedand
allowedPhytagelboilon the magnetic stirrer, finally allowed
to coolthe culture mediumandvacuumflasks,which werestoredin refrigerator.
Keywords: Middle of Murasshine and Skoog, Phytagel, Hydrochloric Acid.
ÍNDICE
Pág.
Antecedentes………………………………………………………………………….…5
Definición del problema…………………………………………………………...….…6
Objetivos…………………………………………………………………………………..7
Justificación…………………………………………………………….……………...…8
Fundamento teórico………………………………………….……………..……………9
Materiales y
Métodos……………………………………………………………......….13
Resultados…………………………………………………………………………….....20
Conclusiones y
Recomendaciones…………………………………………………..21
Fuentes
consultadas…………………………………………..…………………….…22
Anexos…………………………………...………………………………………………23
I.
ANTECEDENTES
El
cultivo de tejido vegetal fue desarrollado a partir de la investigación de
botánicos y fisiólogos vegetales desde 1950. Actualmente se ha convertido en
una herramienta internacional importante en la selección, cruzamiento, control
de enfermedades y producción en masa de cultivos de cosecha e involucra
diferentes plantas en agricultura, horticultura, forestales y frutales.
La
ciencia del cultivo de tejidos vegetales debe su origen a la investigación
sobre hormonas que controlan el crecimiento y desarrollo vegetal. Este
conocimiento se combinó con las técnicas básicas de microbiología por las
cuales los microorganismos se hacen crecer en medios estériles para la
producción de microorganismos e identificación. Desde estas dos fuentes provino
la tecnología por la cual las plantas u órganos de plantas se pueden
multiplicar en gran número, o su crecimiento individual controlado, haciendo
crecer pequeños trozos de tejido vegetal sobre una receta precisa de nutrientes
en un recipiente estéril.
El
cultivo de tejidos ha sido considerado durante mucho tiempo como una mezcla de
ciencia y arte. Fue considerada inicialmente como una técnica particularmente
difícil de aprender. Sin embargo, estas dificultades de los comienzos están hoy
en día prácticamente superadas gracias a factores como la disponibilidad de
antibióticos, los medios de composición definida, las instalaciones asépticas
(salas de cultivo limpias, cabinas de flujo laminar, incubadoras estériles),
dispositivos de cultivo (botellas con tapones filtrantes, placas de Petri ventiladas).
Los avances técnicos y la aparición de un buen número de compañías comerciales de suministro de medios, sueros, equipo y líneas celulares han hecho del cultivo celular una tecnología con buena reproducibilidad (Reina, 2003).
El cultivo de tejidos, como técnica, consiste esencialmente en aislar una porción de la planta (explante) y proporcionarle artificialmente las condiciones físicas y
Los avances técnicos y la aparición de un buen número de compañías comerciales de suministro de medios, sueros, equipo y líneas celulares han hecho del cultivo celular una tecnología con buena reproducibilidad (Reina, 2003).
El cultivo de tejidos, como técnica, consiste esencialmente en aislar una porción de la planta (explante) y proporcionarle artificialmente las condiciones físicas y
químicas
apropiadas para que las células expresen su potencial intrínseco o inducido. Es
necesario además adoptar procedimientos de asepsia para mantener los cultivos
libres de contaminación microbiana (Roca &Mroginski).
II.
DEFINICIÓN DEL PROBLEMA
En
esta presente práctica se busca preparar medios para tejidos vegetales, debido
a que es necesario aprovechar lo que la materia y el laboratorio nos permite a
través de experimentos para desarrollar nuestras inquietudes. Cabe
mencionar que se requiere conocer
exactamente la cantidad de cada uno de los compuestos que hay en el medio, es
por ello que se debe conocer paso por paso la preparación del medio.
III.
OBJETIVOS
3.1 Objetivo general
Ø
Conocer la forma de preparación de los medios
de Murasshine y Skoog y B5 (o de Gamborg) para el cultivo de tejidos vegetales
3.2 Objetivos específicos
Ø Comprender
la función de cada uno de los componentes de un medio de cultivo
Ø Comprender la importancia que tiene la preparación de
los medios para tejidos vegetales.
IV.
JUSTIFICACIÓN
Esta
práctica se realizo con la finalidad de conocer los componentes de los medios
de cultivo así mismo como la cantidad que se requiere de cada uno de las
sustancias utilizadas en la preparación de estos. Los medios de cultivo se
pueden preparar en el laboratorio a partir de cada uno de sus constituyentes
básicos, o por simple rehidratación de productos asequibles comercialmente
(medios de cultivo deshidratados). Generalmente se prefiere el uso de los
medios de cultivo deshidratados porque, además de simplificar el trabajo, con
ellos se tiene mayor probabilidad de obtener resultados reproducibles.
V.
FUNDAMENTO TEORICO
5.1 MEDIOS
DE CULTIVO
Los medios de cultivo son una mezcla de nutrientes que, en
concentraciones adecuadas y en condiciones físicas óptimas, permiten el
crecimiento de los microorganismos,
estos medios son esenciales en el laboratorio por lo que un control en
su fabricación, preparación, conservación y uso, asegurar la exactitud,
confiabilidad y reproducibilidad de los resultados obtenidos. En los
laboratorios se utilizan diferentes tipos de medios de cultivo que pueden ser
preparados en forma líquida o en forma sólida. Usualmente para preparar un
medio sólido, se parte de un medio líquido al que se le añade un agente
solidificante como el agar, la gelatina o la sílicagel. Una
vez que ha sido preparado, un medio de cultivo puede ser inoculado (es decir, se le añaden
organismos) y a continuación incubado en
condiciones que favorezcan el crecimiento. El crecimiento de los
microorganismos es el cultivo.
Un cultivo axénico o puro contiene
un único tipo de microorganismos. Los medios de cultivo deben contener los
nutrientes y factores de crecimiento necesarios y deben estar exentos de
cualquier microorganismo contaminante. Los medios de cultivo contienen como
mínimo: carbono, nitrógeno, azufre, fósforo y sales inorgánicas. En muchos
casos serán necesarias ciertas vitaminas y otras sustancias inductoras del
crecimiento. También se añaden colorantes que actúan como indicadores.El agar es el principal agente solidificante
utilizado en medios. Sedisuelve completamente a 100°C y se solidifica al
enfriarse a 40°C. (Clavell, 1992).
5.2 CLASIFICACION DE MEDIOS
DE CULTIVO
De
acuerdo a su consistencia, los medios de cultivo pueden clasificarse en:
• Líquidos: Se utilizan para el
crecimiento de cultivos puros en lote. Se denominan caldos de cultivo y no tienen agar en su formulación.
• Semisólidos: Contienen 0.5% de agar en
su formulación.
• Sólidos: Contienen de 1.5 a 2% de agar
en su formulación.
De
acuerdo a su composición, los medios de cultivo pueden clasificarse en:
• Definidos: es aquél medio de cultivo
del cual se conoce su composición exacta. Son muy utilizados en estudios
fisiológicos. Los medios mínimos son
medios definidos que únicamente le proporcionan al microorganismo los
nutrientes necesarios para crecer, pero no para desarrollarse óptimamente.
• Complejos: es aquél del cual no se
conoce la composición exacta del medio. Amenudo, los medios complejos emplean
sangre, leche, extracto de levaduras,extracto de carne u otras sustancias muy
nutritivas pero de las cuales se desconoce la composición química exacta. Estos
medios son muy utilizados para cultivar bacterias desconocidas o bacterias de
requerimientos nutricionales muy complejos.
Los medios de cultivo se pueden clasificar de acuerdo a la
naturaleza de sus constituyentes en:
• Medios naturales o complejos: constituidos
por sustancias complejas de origen animal o vegetal, las que son usualmente
complementadas por la adición de minerales y otras sustancias. en ellos no se
conocen todos los componentes, ni las cantidades exactas presentes de cada uno
de ellos.
• Medios definidos o sintéticos: son los medios
que tienen una composición química definida cualitativamente y
cuantitativamente. Generalmente se usan en trabajos de investigación.
De acuerdo al uso del medio de cultivo, éstos se clasifican en:
• Medios de enriquecimiento: son medios
líquidos que favorecen el crecimiento de un tipo de microorganismo en
particular. Permiten aumentar el número de microorganismos de ese tipo.
Usualmente contienen una o más sustancias inhibidoras del crecimiento de los
microorganismos con excepción de los que se quieren cultivar.
• Medios selectivos: son parecidos a los de
enriquecimiento, se diferencian por ser medios sólidos y están diseñados para
el aislamiento de microorganismos específicos.
• Medios diferenciales: son medios que
contienen indicadores de productos derivados de la actividad microbiana de los
microorganismos. no contienen ningún tipo de sustancia con actividad
antimicrobiana, permiten revelar características fisiológicas de los
microorganismos.
Los medios de cultivo se pueden preparar en el laboratorio a
partir de cada uno de sus constituyentes básicos, o por simple rehidratación de
productos asequibles comercialmente (medios de cultivo deshidratados),
generalmente se prefiere el uso de los medios de cultivo deshidratados porque,
además de simplificar el trabajo, con ellos se tiene mayor probabilidad de
obtener resultados reproducibles.(Gutiérrez, 2001).
5.3 ASPECTOS PARA
PREPARAR DE MEDIOS DE CULTIVO
• prepararlos sólo a partir de productos que
provengan de fabricantes o proveedores que suministren productos de calidad.
• utilizar agua destilada o desmineralizada con
una calidad microbiológica y fisicoquímica adecuada.
• utilizar materiales de vidrio bien lavados y
enjuagados con agua destilada o desmineralizada.
• controlar el tiempo y la temperatura
recomendada durante su esterilización. Nunca se deben exceder las condiciones
señaladas por el fabricante.(Gutiérrez, 2001)
5.4 ALMACENAMIENTO DE LOS
MEDIOS DE CULTIVO
Los medios de cultivo deshidratados se deben almacenar en envases
sellados bajo las condiciones que señale el fabricante, generalmente se
almacenan en un lugar fresco (entre 15 y 25°), con poca humedad y protegidos de
la luz solar directa. Nunca se deben almacenar cerca de autoclaves, hornos, ni
otra fuente de calor o vapor.
Una vez que el
medio de cultivo ha sido preparado y esterilizado se debe almacenar entre 2 y
8º C, amenos
que el medio requiera alguna condición diferente. Se deben mantener en
recipientes bien cerradospara evitar su deshidratación. Cuando se usa tapón de
algodón se debe colocar por encima una envolturade papel (Craft). (Dugas, 1999).
I.
MATERIALES Y METODOS
La practica tuvo lugar en el
laboratorio de Microbiología perteneciente al Instituto Tecnológico de Cd. Altamirano. Para la preparación de 350 mL de
medio M.S partiendo de soluciones concentradas de sales y orgánicos a 100
x, añadiendo 30 g / L de sacarosa y 3 g
/ L de phytagel, se llevo acabo la siguiente metodología.
Primeramente se realizó un flujo para
saber la cantidad exacta que se
agregarían de cada una de las soluciones stock y los componentes como sacarosa
y phytagel.
PREPARACIÓN DE
UN MEDIO DE CULTIVO M.S
|
||
FLUJO
|
L
|
350 ML
|
SOLUCIÓN DE NITRATOS
|
10 mL
|
3.5 mL
|
SOLUCIÓN DE SULFATOS
|
10 mL
|
3.5 mL
|
SOLUCIÓN DE QUELATOS
|
10 mL
|
3.5 mL
|
SOLUCIÓN DE Po Bo Mo
|
10 mL
|
3.5 mL
|
SOLUCIÓN DE HALOGENOS
|
10 mL
|
3.5 mL
|
SOLUCIÓN DE ORGÁNICOS
|
10 mL
|
3.5 mL
|
SACAROSA
|
30 g
|
10.5 g
|
PHYTAGEL
|
3.0 g
|
1.05 g
|
Posteriormente se
colocaron las seis soluciones stock sobre la mesa del centro del laboratorio,
al lado derecho de cada botella que contenía la solución, se encontraba una
pipeta correspondiente a cada una de ellas.
En un vaso de precipitados de 500 mL o
un litro, se colocó 100 mL de agua (bonafont), después con la pipeta
correspondiente se agregó 3.5 mL de cada una de las seis soluciones stock (
Solución de Nitratos, Solución de Sulfatos, Solución de Quelatos, Solución de
Po Bo Mo, Solución de Halógenos y Solución de Orgánicos).
Posteriormente se adicionó la
sacarosa, de la cual se pesaron previamente 10.5 g en la balanza analítica, con
una pipeta se removió hasta que esta se disolviera perfectamente. Después en
una probeta de 500 mL se aforó a 350 mL, se realizó un lavado del vaso de
precipitados para evitar que quedaran residuos de los componentes del medio.
Una vez aforada la solución se vertió
nuevamente en el vaso de precipitados para medir el pH el cual debía de estar
en un rango de 5.7 a 6.0, empleando el potenciómetro. En caso de que
obtuviéramos un pH bajo, se le agregaría NaOH hidróxido sódico de lo contrario si el pH sobrepasara
6.0 se agregaría HCL ácido clorhídrico 0.1 N.
Posteriormente se le agregó un magneto
al medio y se procedió a calentar en una parrilla calefactora con agitación
magnética, a una temperatura de 50 a 70 ºC, se midió la temperatura con un
termómetro y una vez alcanzada se agregó 1.05 g de phytagel, esto se hizo poco
a poco para evitar que se formaran grumos.
Ya que se implemento el phytagel se incremento la intensidad de calor
hasta que hirviera. Después en frascos de cultivo se vertió el medio M.S, con
mucho cuidado ya que estaba caliente, tomando la medida de un frasco llenado
con agua, al termino de llenado de estos se taparon, sellaron cinta plástica y se
mantuvieron en refrigeración.
I.
RESULTADOS
Para preparar 350 ml de medio MS partiendo de soluciones stock
de sales y orgánicos a 100X, se añadieron 30 g/l de sacarosa y 3 g/l de
phytagel.
Cálculos necesarios:
Para las soluciones
Se midió el pH el cual se
encontraba muy acido y se ajusto con la ayuda del acido clorhídrico hasta 5.72.
De
los 350 ml del medio Murasshine y Skoog se
obtuvieron 15 frascos de 23 ml para el cultivo de tejidos vegetales, los cuales
fueron puestos bajo refrigeración.
I.
CONCLUSIONES Y RECOMENDACIONES
Conclusión:
De
acuerdo con lo realizado en la presente práctica se concluye que es de gran importancia preparar adecuadamente los medios de cultivo,
añadir la cantidad de solución exacta y disolverla correctamente para obtener
los resultados esperados; además de que observamos que la solución stock es mas
acida
Recomendaciones:
De acuerdo a esta
práctica se recomienda que potenciómetro este calibrado ya que se pierde tiempo
en tratar de calibrarlo, que para la posterior practica se le apliquen
reguladores de crecimiento al medio de cultivo
ya que en esta práctica no se agregaron.
II.
FUENTES CONSULTADAS
v Clavell,
L.; Pedrique de Aulacio, M. 1992. Microbiología. Manual de Métodos Generales
(2da edición). Facultad de Farmacia. Universidad Central de Venezuela
v Sofía
Gutiérrez de Gamboa, Octubre 2001.
http://www.ucv.ve/fileadmin/user_upload/facultad_farmacia/catedraMicro/10_Preparaci%C3%B3n_de_medios_de_cultivo.pdf
v Dugas Beverly Tratado de Enfermería Práctica Nueva Editorial
Interamericana México, 1999.
http://es.scribd.com/doc/14173118/4-Esterilizacion-y-Preparacion-de-Medios-de-Cultivo
v Biotecnología
Vegetal (cultivo de tejidos, manual
)Gonzalez, Cruz, Camarillo, Silos. 2000. SEP. 133p.
v La
Ingeniería Genética y sus Aplicaciones. Pellon. Acribia. 1986. Mexico. 237 p.
v Introduction to Biotechnology and Genetic Engineering. Nair. Infinity
Science Press. India. 2008.
791 p.
v http://exa.unne.edu.ar/biologia/fisiologia.vegetal/CultivoTejidos.pdf
III.
ANEXOS
Es
necesario que el laboratorio cuente con medidores de pH debido a que con los que cuenta el
laboratorio no se encuentra en buenas condiciones y no están calibrados
correctamente.
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