PREPARACIÓN DE SOLUCIONES MADRES

              SEP                           SNEST                           DGEST

INSTITUTO TECNOLOGICO DE CIUDAD ALTAMIRANO

MATERIA: BIOTECNOLOGIA APLICADA

PRACTICA No.2

PREPARACIÓN DE SOLUCIONES MADRES

PROFESOR: MC. FRANCISCO JAVIER PUCHE ACOSTA

LIC EN BIOLOGIA           VIII SEMESTRE

PRESENTAN:

Ma. Yesenia Balandrano Alonso (08930258)

Diana Vely García Banderas (08930286)

ANEL MOJICA MACEDO (08930287)

Mayra Alejandra Nambo Pérez (08930349)

Berenice Rubí Pérez Sánchez (08930354)

                         Cd. Altamirano, Gro. México. 27 de Febrero del 2012

PREPARACIÓN DE SOLUCIONES MADRES

Yeka_rys@hotmail.com; diana_v_eli@hotmail.com; anel_m89@hotamail.com; may_anp1307@hotmail.com; melisa992 @hotmail.com

RESUMEN

La presente práctica se realizo en el laboratorio de usos múltiples del Instituto Tecnológico de Cd. Altamirano Gro. Cuyo objetivo fue conocer los diferentes componentes del medio de cultivo y su naturaleza Química y Bioquímica, así como manejar las técnicas básicas a través del uso adecuado de reactivos. Para lo cual se requirió vasos de precipitados, probetas, agua destilada, frascos ámbar y reactivos para preparan las distintas soluciones, en nuestro caso se trabajo con la solución de Fosfatos, Boratos y Molibdatos, para ello se pesaron 4.25 g de KH₂PO₄, 0.155 g de H₃B0₃ y 0.00625 g de Na₂MoO₄2H₂O, posteriormente se disolvieron en matraz a 100 ml y por ultimo se aforo a 200 ml con agua destilada. Por lo que se obtuvo una solución de Fosfatos, Boratos y Molibdatos concentrada a 100X, la cual fue etiquetada y guardada a 4 ⁰C. Así, esta práctica será de gran utilidad para la preparación de medios de cultivo, ya que estas soluciones se encuentran concentradas a 100X  y su manejo será más fácil y apropiado.

Palabras clave: medio de cultivo, reactivos, solución de Fosfatos, Boratos y Molibdatos

PREPARATION OF SOLUTIONS MOTHERS

Yeka_rys@hotmail.com; diana_v_eli@hotmail.com; anel_m89@hotamail.com; may_anp1307@hotmail.com; melisa992 @hotmail.com

Abstract

This practice was held in the Multipurpose Laboratory Technological Institute of Ciudad Altamirano Gro. Aims to better understand the different components of culture medium and the nature of Chemistry and Biochemistry, and manage the basic techniques through proper use of reagents. Which was required for beakers, test tubes, distilled water, amber vials and reagents for preparing the various solutions, in our case we worked with the solution of phosphates, borates and molybdates, for it weighed 4.25 g of KH2PO4, 0.155 g and 0.00625 g H3B03 Na2MoO42H2O subsequently dissolved in 100 ml flask and finally diluted to 200 ml with distilled water. So as to obtain a solution of phosphates, borates and concentrated Molybdates 100X, which was labeled and stored at 4 0C. Thus, this practice will be useful for the preparation of culture media, as these solutions are concentrated at 100X and its handling is easy and appropriate.

Keywords: culture media, reagents, solution of phosphates, borates and molybdates.

ÍNDICE

Pág.

Antecedentes………………………………………………………………………….…5

Definición del problema…………………………………………………………...….…6

Objetivos…………………………………………………………………………………..7

Justificación…………………………………………………………….……………...…8

Fundamento teórico………………………………………….……………..……………9

Materiales y Métodos……………………………………………………………......….13

Resultados…………………………………………………………………………….....20

Conclusiones y Recomendaciones…………………………………………………..21

Fuentes consultadas…………………………………………..…………………….…22

Anexos…………………………………...………………………………………………23

I.             ANTECEDENTES

Un método de hacer menos tedioso el trabajo consiste en preparar lo que se conoce como "soluciones madre" de algunos de estos componentes. Estas soluciones tienen una concentración que suele ser 10, 100 e incluso 1000 veces superior a la concentración final del medio. Su ventaja no estriba sólo en el hecho de que hay que pesar menos veces cada vez que se prepara el medio sino también la exactitud de la pesada ya que algunos compuestos están tan diluidos en la solución final, que la pesada que habría que hacer estaría por debajo de los límites de exactitud de las balanzas de precisión.

Las soluciones madre se conservan en frigorífico y en bote topacio durante algunos meses, desechándose ante cualquier señal de precipitación.

Se suelen preparar soluciones madre de las sales minerales, los aminoácidos, hormonas, vitaminas y hexitoles, mientras que la fuente de carbono y el agente gelificante se pesan cada vez ya que se necesitan en cantidades muy elevadas y no se conservan bien en solución.

En el caso de las hormonas es mejor preparar una solución madre de cada una de ellas y medir volúmenes determinados y congelarlos en un frigorífico de 4 estrellas.

II.           DEFINICIÓN DEL PROBLEMA

Para la preparación de soluciones madres (medio de cultivo) se debe cumplir con una serie de normas, esto es para cualquier combinación ya que si no se cumplen como se debe el resultado no será exitoso, sino un total fracaso y de ser así nuevamente se realizaría la preparación del medio de cultivo. Es por ello que se debe tener un orden y sobre todo mucha concentración al preparar el medio, pero cabe mencionar que se requiere de un mayor número de  balanzas analíticas debido a que el laboratorio solo cuenta con 2 y  2 no son suficientes ya que se pierde tiempo al esperar que se desocupen las balanzas para continuar con el proceso de preparación.

III.         OBJETIVOS

3.1 Objetivo general

Conocer los diferentes componentes del medio de cultivo y su naturaleza Química y Bioquímica.

3.2 Objetivos específicos

Ø  Manejar las técnicas básicas a través del uso adecuado de reactivos.

Ø  Comprender la importancia nutricional de los componentes de los medios de cultivo.

IV.        JUSTIFICACIÓN

Esta práctica se realizó con la finalidad de  conocer los diferentes componentes de un medio de cultivo así como su naturaleza química y bioquímica aunado a esto nos ayudo aprender a determinar los valores y la composición de una solución Stock, ya que se debe medir cuidadosamente en términos de volumen y masa, por lo tanto es indispensable conocer la cantidad de soluto disuelto por unidad de volumen o masa de disolvente, es decir su concentración, debido a que durante el desarrollo de cualquier trabajo experimental relacionado con la propagación in vitro de explantes vegetales, el uso de soluciones Stock se hace indispensable, ya que estas comprenden el balance nutricional de los componentes de un medio de cultivo por lo que es necesario conocer los procedimientos para su elaboración.

V.          FUNDAMENTO TEORICO

5.1  MEDIO PARA CULTIVAR MATERIAL VEGETAL

Son muchos los elementos de un medio para cultivar material vegetal in vitro:

-       Sales minerales que incluyan todos los elementos esenciales tanto micro como macronutrientes

-       Vitaminas tales como rivoflavina, tiamina, piridoxina, acido nicotínico, acido pantotenico, biotina y acido fólico

-       Aminoácidos tales como L-glutamina, asparagina y cisteína

-       Hexitoles como mio-inositol

-       Hormonas y reguladores de crecimiento

-       Fuente de carbono

-       Agente gelificante

5.2  SOLUCIONES MADRE

Estas soluciones tienen una concentración que suele ser de 10, 100 e incluso 1000 veces superior a la concentración final del medio. Su ventaja no estriba solo en el hecho de que hay que pesar menos veces cada vez que se prepara el medio sino también la exactitud de la pesada ya que algunos compuestos están diluidos en la solución final, que la pesada que habría que hacer estaría por debajo de los límites de exactitud de las balanzas de precisión. Las soluciones madre se conservan en frigorífico y en bote topacio durante algunos meses, desechándose ante cualquier señal de precipitación.

Se suelen preparar soluciones madre de las sales minerales. Aminoácidos, hormonas, vitaminas y hexitoles, mientras que la fuente de carbono y el agente gelificante se pesan cada vez ya que se necesitan en cantidades muy elevadas y no se conservan bien en solución; En el caso de las hormonas es mejor preparar una solución madre de cada una de ellas y medir volúmenes determinados y congelarlos en frigoríficos de 4 estrellas

Las soluciones deben prepararse con mucho cuidado y precisión. Las sales deben pesarse en una balanza granataria (precisión= 0.01 g) y en la balanza analítica se pesaran las vitaminas y reguladores de crecimiento (precisión = 0.0001 g). La conservación de las soluciones madres se hará de 4-5 C. en el refrigerador, es recomendable no prolongar por más de tres meses la conservación de las soluciones madres de sales minerales. Las que contengan vitaminas y sustancias de crecimiento estables podrán conservarse un máximo de 4 semanas.

5.3  FORMULACIONES PARA PREPARACION DE SOLUCIONES MADRE

 Sales minerals MS (g/l)

(NH₄ )NO₃                      1.650

KNO₃                           1.900

CaCl₂.2H₂O                   0.440

MgSO₄.7H₂O                0.370

KH₂PO₄            0.170

FeSO₄.7H₂O                 0.0278

Na₂EDTA. 2H₂O            0.0372

MnSO₄.H₂O                  0.0169

ZnSO₄.7H₂O                 0.0086

H₃BO₃                          0.0062

KI                                0.00083

Na₂MoO₄.2H₂O             0.00025

CuSO₄.5H₂O                 0.000025

CoCl₂.6H₂O                   0.000025

Mioinositol                   0.100

Tiamina HCl                  0.0001

Acido nicotínico                       0.0005

Piridoxina HCl              0.0005

Glicina                         0.002

5.4  NORMAS GENERALES A LA HORA DE PESAR

-       Comprobar los cálculos. Y tener en cuenta que los valores de las soluciones madre están expresados para un litro

-       Leer las características del reactivo que se va a pesar. Algunos son tóxicos por inhalación o en contacto con la piel y hay que mantener las debidas precauciones.

-       Desde 0.01 g se utilizará la balanza  granataria. Para valores inferiores la balanza de precisión.

-       Antes de pesar hay que tarar el recipiente donde se está haciendo la pesada. Nunca se debe pesar directamente sobre el platillo de la balanza.

-       Antes de introducir la cucharilla de pesar en un frasco de reactivo hay que asegurarse de que esté limpia y seca. Es una precaución que evita la contaminación de los reactivos

-       Hay que tener la precaución de tomar del frasco de reactivo muy poca cantidad de modo que en la medida de lo posible se evite devolver al frasco parte de lo que se tomó.

5.5  NORMAS GENERALES A LA HORA DE PREPARAR LAS DISOLUCIONES

-       Si la disolución se va a remover con un agitador mecánico el mejor recipiente es un vaso de precipitados. Si la agitación es manual, suele ser mejor un erlenmeyer.

-       Antes de empezar a añadir los solutos se deberá poner un 70% del volumen total de agua

-       Cuando una disolución incluya más de un reactivo, estos se añadirán uno a uno y teniendo la precaución de no añadir uno hasta que el otro esté totalmente disuelto.

-       Para enrasar al volumen final se utiliza un matraz aforado o una probeta, nunca un vaso de precipitados o un erlenmeyer.

-       Una vez preparada se debe guardar en un frasco perfectamente etiquetado en el que figuren los siguientes datos:

Tipo de solución. Ej. Macro de MS

-       Grado de concentración. Ej 100 X (100 veces más concentrada que la solución final)

-       Componentes con fórmula y peso en g/l

-       Fecha de preparación.

VI.             MATERIALES Y MÉTODOS

La practica tuvo lugar en el laboratorio de usos múltiples  perteneciente al Instituto Tecnológico de Cd.  Altamirano. Para poder dar inicio con los procedimientos de esta, primeramente se organizaron lo estudiantes en seis grupos de trabajo, cada grupo  prepararon una solución madre  stock de Murashige & Skoog MS. Nuestro equipo trabajo en la preparación de la solución de Fosfatos, Boratos y Molibdatos; la práctica se desarrollo de la siguiente manera:

6.1 Cálculos Para Determinar Los Gramos Necesarios De La Solución De Fosfatos, Boratos Y Molibdatos

Se  Realizaron previamente los cálculos necesarios para determinar los gramos exactos que se utilizaron de la solución de Fosfatos, Boratos y Molibdatos.

REACTIVOS
COMPONENTES	NOMBRE	CANTIDAD EN g/L
KH2PO4	Fosfato Monopotásico	0.170
H3BO3	Ácido Bórico	0.062
Na2MoO4.2H2O	Molibdato De Sodio Dihidratado	0.00025

Preparar 200 ml de solución de Fosfatos, Boratos y Molibdatos a una concentración de 100x

1) Fosfato Monopotásico.  KH₂PO₄

La cantidad utilizada en g/L de este componente es 0.170, esta se multiplicó por la concentración que fue 100x y nos dio como resultado 17 g / L. Posteriormente se realizaron cálculos mediante una regla de tres para determinar cuantos gramos utilizaríamos para un volumen de 200 mL, se realizó el siguiente procedimiento:

17 g   ------------  1000 mL

 X      ------------   200 mL

    (200 mL)(17 g)                3400 g/mL

___________    =      ____________    =  3.4 g

   1000 mL                  1000 mL

Teniendo en cuenta que se utilizan 17 g para un litro ( el cual es equivalente a 1000 mL ) a una concentración de 100x se multiplico el volumen que íbamos a emplear  200 mL por 17 g y se dividió en 1000 mL obteniendo como resultado 3.4 g, este mismo procedimiento se utilizo para los siguientes dos reactivos.

2) Ácido Bórico.   H₃BO₃

6.2 g                              1000 mL

 X                                    200 mL

    (200 mL)(6.2 g)                1200 g/mL

                              =                               =  1.24 g

   1000 mL                  1000 mL

3) Molibdato De Sodio Dihidratado.  Na₂MoO₄.2H₂O

0.025 g                              1000 mL

    X                                     200 mL

    (200 mL)(0.025 g)                5 g/mL

                                =                                =   0.005 g

   1000 mL                  1000 mL

6.2 Procedimiento en laboratorio para la preparación de la solución de Fosfatos, Boratos Y Molibdatos.

Una vez que se obtuvieron las cantidades de cada componente se procedió en el laboratorio a buscar cada uno de ellos en el área de reactivos, posteriormente se peso la cantidad que necesitaríamos de cada componente en la balanza analítica, se pesó 3.4 g de KH₂PO₄, 1.24 g de H₃B0₃  y 0.005 g de Na₂MoO₄2H₂O.

Figura 1.  Búsqueda e identificación            Figura 2.  Componentes de la solución de Fosfatos, Boratos y Molibdatos.               de cada componente de la solución.             

Figura 3.  Pesado de KH₂PO₄  3.4 g.                Figura 4.  Pesado de H₃B0₃  1.24 g.

Figura 5. Vertido de agua destilada en un matraz de Erlenmeyer a un volumen aproximado de 100 mL.

 

Figura 6. Agregado de un componente        Figura 7. Enjuagado del contenedor

    de la solución en agua destilada.                  del componente.

Figura 8. Dilución de los componentes

Figura 9. Vertido de solución madre de Fosfatos, Boratos y Molibdatos en una botella color ámbar.

Contando ya con el peso exacto de cada uno de los componentes, en un matraz de Erlenmeyer se vertió 100 mL de agua destilada, después se agregó cada uno de los componentes, para tener la seguridad de que no quedaran residuos de las sales en los contenedores donde se pesaron se agregó aproximadamente 10 mL de agua para enjuagarlo y se incorporo al matraz, con ayuda de una pipeta se revolvió la solución hasta que las sales se disolviera perfectamente en el agua destilada. Se vació en una probeta graduada y se aforó a 200 mL, finalmente se vertió en una botella color ámbar previamente etiquetada con los siguientes datos: nombre de la solución madre, concentración y volumen de la misma, nombre del equipo y fecha de preparación, esta se tapó y se refrigeró a una temperatura de 9 ºC.

VII.             RESULTADOS

Una vez calculados los gramos a pesar para la solución de Fosfatos, Boratos y Molibdatos se obtuvo lo siguiente:

REACTIVOS
COMPONENTES	NOMBRE	CANTIDAD EN g/L
KH2PO4	Fosfato Monopotásico	3.4 g
H3BO3	Ácido Bórico	1.24 g
Na2MoO4.2H2O	Molibdato De Sodio Dihidratado	0.005 g

Así que una vez disueltos se obtuvo un solución de Fosfatos, Boratos y Molibdatos concentrada a 100X  y lista para la preparación de medios de cultivo vegetales (MS).

Figura 13. Solución de Fosfatos, Boratos y Molibdatos (100X)

VIII.             CONCLUSIONES Y RECOMENDACIONES

De acuerdo a los resultados de la presente practica se concluye que para obtener los resultados esperados se debe pesar correctamente los reactivos, disolverse en menos agua de la que se pretende aforar esto porque si disolvemos exactamente la cantidad de agua con la que se va aforar a la hora de enjuagar el recipiente la cantidad de agua es mayor y los resultados ya no son los esperados.

De acuerdo a lo antes mencionado se recomienda que los reactivos se acomoden de forma correcta de acuerdo a la sales que estos contengan como nitratos, sulfatos, quelatos, halógenos, etc. esto para encontrar más rápido los reactivos y no perder tiempo en ello ya que el tiempo de prácticas es muy corto y debe aprovecharse.

IX.           FUENTES  CONSULTADAS

v  Pierik R.L. 1991. Cultivo in Vitro de plantas superiores. 1 Ed. Mundiprensa España

v  http://www.rena.edu.ve/cuartaEtapa/quimica/Tema3.html

v  http://www.veterinaria-online.com.ar/libros-gratis/preparacion-de-medios-de-cultivo-doc.html

v  http://florescienciayalgomas.blogspot.com/2009/07/cultivo-in-vitro-preparacion-de.html

X.         ANEXO

En la práctica realizada nos dimos cuenta que el laboratorio de biotecnología no cuenta con suficientes balanzas analíticas las cuales son esenciales para pesar las sustancias a utilizar en los medios de cultivo.

Figura 14. Balanza analítica

Otro aspecto importante es que en el anaquel no se encuentran ordenadas las sustancias, es por ello que se recomienda que se ordenen de manera alfabéticamente.